每个人的身体内部都有一支隶属于我们个人的专属军队——免疫细胞，为保卫我们的健康冲锋陷阵，万死不辞。NK细胞（Natural Killer Cell，中文名：自然杀伤细胞）是这支军队当中非常重要的组成部分，它们是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞。

NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞来源于CD34+共淋巴祖细胞。据估计，NK细胞的半衰期大约为7~10天，占人类外周血淋巴细胞总数的10-15%，也存在于脾脏、肝脏、肺、骨髓和淋巴结中，它们通过与DC细胞的相互作用发挥关键的免疫调节功能。

NK细胞是第一组固有淋巴样细胞的典型成员，具有分泌 IFN-γ 的能力。终末分化的 NK 细胞缺乏B淋巴细胞（CD19+）和 T 淋巴细胞（CD3+）的表型标记，CD56是NK细胞特征的标志。人外周血NK细胞可分为CD56bright和CD56dim两大类。

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NK细胞疗法概述

CAR-T 细胞疗法发展迅速，但在临床应用中仍存在不足（诸如在实体瘤治疗中的困扰；因患者疾病不同产生的差异性，有不同程度的神经毒性和细胞因子风暴）。这也是CAR-T 治疗今后改进的一个方向。

NK细胞，一个充满潜力的候选疗法。NK细胞来源非常广泛，比如外周血、脐带血、诱导多能干细胞（iPSC）和NK细胞系。细胞因子风暴（CRS）主要是由CAR-T细胞分泌的INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因子等诱导的。然而，NK细胞分泌IL-3和GM-CSF，因此不太可能引起CRS。同时，由于肿瘤微环境中PD-1的表达，CAR-T细胞的功能受到抑制。NK细胞分泌PD-1的水平较低，免疫抑制作用较小。此外，NK细胞可促进DC细胞迁移到肿瘤中，从而增强抗PD-1免疫治疗。

NK细胞对肿瘤细胞具有一定的杀伤效果，而且不受MHC识别的限制，是肿瘤免疫治疗的潜在治疗方式。异体NK细胞移植几乎不会诱发移植物抗宿主病（GVHD），不会导致CRS，可以作为完全“现货型”产品使用。

以上这些优点，使NK细胞成为抗实体瘤的理想候选细胞。

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CAR-NK细胞疗法概述

CAR（嵌合抗原受体）技术是基因工程与免疫疗法的完美融合，是当前肿瘤治疗领域具前景的研究方向之一。CAR-NK细胞，由识别肿瘤特异抗原的细胞外信号结构域、跨膜区和细胞内结构域组成，它们可以建立新的激活途径，以增强靶细胞的溶解。

CAR-NK细胞，不仅通过CAR特异性识别抗原表达肿瘤的能力，而且通过NK细胞受体自身来消除肿瘤。NK细胞的活性取决于是刺激和抑制信号的平衡，而不是抗原特异性。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。NK细胞的另一种杀伤机制，涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。因此，CAR-NK细胞的靶向裂解基于CAR依赖和NK受体依赖机制，并且裂解也适用于抗原阴性膜的肿瘤。

在临床前和临床试验中，CAR-NK细胞疗法当之无愧成为细胞疗法中的热门选手。

CAR-NK细胞治疗的临床应用

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CAR-NK细胞的来源

目前，CAR-NK细胞主要来源包括外周血、脐血、诱导多能干细胞（iPSC）和NK92细胞系。经常使用的是捐赠者外周血提取的NK细胞，但不同捐赠者外周血扩增的NK细胞可能存在差异。因此，对纯化要求较高。

诱导多能干细胞（iPSC），是指将终末分化的体细胞通过导入特定的转录因子重编程为多能干细胞。iPSC的优点较多，包括制备需少量供体细胞，可进行无限培养，成本较低，可实现自体供给，免疫原性较低。

iPSC来源的NK细胞

目前iPSC目前主要处于科研阶段，Fate Therapeutics 基于平台量产 iPSC-NK细胞，实现规模化量产，且NK细胞可保持高度均一性。异体 iPSC可能存在致瘤性、免疫原性和异质性问题。致瘤性主要源于iPSC无限增殖的特性，失控的细胞增殖可能导致肿瘤的形成；异质性主要源于每个iPSC细胞系在分化和增殖中的差异。

图：iPSC细胞制备流程

NK92细胞系

NK92细胞系，这种细胞系是从一位患有急性非霍奇金淋巴瘤的患者提取的细胞系。优点是可无限增殖，对冻融敏感性较低，但NK92细胞不表达CD16受体，先天缺乏ADCC功能。由于来源于淋巴瘤细胞，给药前需要辐射照射，让其半衰期变短。因此，在临床中需要多次给药或全身给予IL-2维持NK细胞活性，这导致额外的风险。

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全球CAR-NK细胞疗法的研究现状

目前，全球CAR-NK细胞疗法的开发正在如火如荼地开展中。据统计，从临床阶段的角度，绝大多数CAR-NK细胞疗法正处于临床Ⅰ期，占比约68%，处于Ⅱ期的项目约32%，尚无CAR-NK细胞疗法进入临床Ⅲ期。

血液瘤中的临床前研究

表1、CAR-NK细胞在血液瘤中的临床前研究

实体瘤中的临床前研究

表2、CAR-NK细胞在实体中的瘤临床前研究

CAR-NK细胞的临床研究

根据clinical.gov网站上的临床数据，已有200多项关于CAR-T细胞的研究。然而，只有9项涉及CAR-NK细胞。

表3、CAR-NK细胞在血液瘤和实体瘤中的临床研究

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CAR-NK细胞疗法的挑战和解决方案

CAR-NK细胞疗法的改进

迄今为止，CAR-NK细胞疗法进行了广泛的临床前研究。肿瘤异种移植（PDX）模型，是临床肿瘤的经典模型，因为它直接将肿瘤从患者转移到NSG或NOG小鼠。大多数CAR-NK细胞疗法在临床前试验中已在PDX模型中进行了疗效评估，包括针对血液瘤靶点（诸如CD19、CD20、CD138和CS-1）和实体瘤（诸如HER2、GD2、PSCA和EGFRvIII）。与PDX相比，人源化小鼠更为精确。通过将造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内以使其发育人类免疫系统，克服了PDX模型未能观察到CAR-NK/T对肿瘤微环境中宿主免疫细胞的影响的失败。

临床应用挑战和解决方案

CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，如果要扩大其临床应用，必须要解决一些基本问题。

首先，NK细胞体外培养扩增是第一道障碍。单个供体的NK细胞数量太少，不足以进行治疗，这使得NK细胞的扩增和激活变得非常关键。通常需要2-3周时间来培养NK细胞。供体细胞数量的可用性仍然是一个障碍。此外，必须完全清除里面混杂的T细胞，以防止GVHD。因此，如何获得足够的NK细胞仍是一个挑战。从iPSC里获得大量的NK细胞是一个不错的选择。

第二，选择合适CAR很关键。目前大多数的CARs是为构建CAR-T细胞而设计的。因此，对于NK细胞来说并不是佳选择。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离影响其结合抗原和激活CAR-NK细胞的能力。

第三，如何将CAR转到NK细胞，这是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。到目前为止，病毒载体和非病毒载体都被用来转化CAR。逆转录病毒载体的转染效率很高，但可能会引起插入突变、致癌和其他不良反应。慢病毒载体插入突变发生率较低，但转染效率低（约20%）。睡美人系统已应用于CAR-T。对CAR-NK结构的是否适用尚不清楚。mRNA转染也被认为是一种安全、实用的转染方法。

后，NK细胞对冻融过程敏感。解冻后NK细胞的存活率和细胞毒性显著降低。如果加入IL-2，则可以部分恢复冷冻NK细胞的活性。为了使细胞冷冻保存成为可行的佳策略，必须对冷冻NK细胞进行探索。

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如何提高CAR-NK的安全性和有效性

CAR-NK细胞疗法的安全性

将自杀基因整合到CARs中，可以提高CAR-NK细胞治疗的安全性。HSV-TK/GCV自杀系统，在20世纪90年代首次用于造血干细胞移植。凋亡途径（如Fas和caspase9），也已经被用作自杀系统。

自杀基因

CAR由阻断抗原结合位点的掩蔽肽和蛋白酶结合点组成。当蛋白酶从肿瘤微环境（TME）中的掩蔽肽分离时，CAR-T细胞可以在肿瘤局部保持活性。将HIF1的氧敏感域与CAR结构融合，设计了氧敏感CAR。此外，CAR-T被设计成当synNotch和CAR配体在肿瘤上共同表达时激活，这是一种在空间上识别并有效控制CAR-T细胞激活的策略。

CAR-NK细胞疗法的有效性

设计CAR-NK细胞，沉默NK抑制受体可使其对肿瘤有更强的抵抗力。当IL-4和IL-7受体结构域与反向细胞因子受体（4/7 ICR）融合，并添加到CAR中时，发现来源于肿瘤的IL-4抑制作用降低从而，促进了CAR-T细胞的增殖。转染CAR/ICR的T细胞，在体内对含IL-4的TME具有持续的抗肿瘤作用。考虑到CAR-NK细胞的特异性，ICR受体（IL-15，IL-21）是否适用于CAR-NK细胞，尚需研究。

有趣的是，以4-1BB作为共刺激分子的CAR-T细胞依赖于氧化代谢，可增强线粒体活性、促进T细胞增殖和维持T细胞持久性，并增强抗PD-1活性。因此，可以尝试通过调节CAR-NK细胞的代谢来提高疗效。

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文末小结

NK 细胞具有独特的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。

CAR-NK 细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。相信，CAR-NK细胞疗法可能会导致肿瘤免疫治疗的革命性进展。

参考资料：

[1]CAR-NK for tumor immunotherapy: Clinical transformation and future prospects[J].Cancer LettersVolume 472, 1 March 2020, Pages 175-180.

[2] CAR-expressing NK cells for cancer therapy: a new hope.BiosciTrends. 2020 Sep 6.[3]. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy.Cancers(Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131

[4]Engineering the next generation of CAR-NK immunotherapies.Int J Hematol. 2021 Aug 28 : 1–18.