通过在含有StemSpan™红系扩增添加物的StemSpan™无血清扩增培养基（例如StemSpan™SFEM II）中培养CD34⁺ 造血干细胞和祖细胞（HSPCs）可以产生大量的红系细胞。红系扩增添加物包含以下的细胞因子：干细胞因子（SCF）、白细胞介素3（IL-3）和促红细胞生成素（EPO），它们一起促进HSPCs的增殖和分化，使每个培养的CD34⁺细胞在经过1-3周的培养后产生数千个成红细胞。这些经培养扩增的成红细胞大多表达转铁蛋白受体（CD71）和血型糖蛋白A（GlyA、CD235a），但对于血红蛋白（Hb）的表达，则很少甚至缺乏。当细胞被移至合适的培养条件，这些细胞有能力成熟为血红蛋白正常细胞和网织红细胞。下面介绍一种我们建议的细胞成熟方案。

此方案高效的促进从脐带血或骨髓CD34⁺细胞衍生的有核红细胞的成熟和血红素的生成。需注意的是，不同实验所产生的细胞数量和存活率可能有所不同。如果需要，可以调整此流程，引入基质细胞的共培养^1-8。

需要材料：

• CD34⁺ cells（从脐带血或骨髓中新鲜分离或冷冻保存的细胞）

• StemSpan™ SFEM II Medium

• StemSpan™ 红系扩增添加物

• Erythropoietin (EPO)

• 人AB血清

• 组织培养板

• 普通实验室设备（培养箱、离心机及移液器等）

• 人CD71 抗体

• 人GlyA 抗体

步骤1. 扩增细胞

在含有StemSpan™红系扩增添加物的StemSpan™ SFEM II培养基中，以每毫升～10,000个CD34⁺细胞进行接种。在第4天添加新鲜的培养基和添加物，然后每隔3～4天在新鲜培养基（含添加物）中重新接种或稀释细胞至每毫升～1×10⁵个细胞。如培养得当，细胞将继续增殖并在两周以上产生CD71⁺GlyA⁺有核红细胞。

步骤2. 收获和清洗经扩增培养的成红细胞

收集细胞，同时使用例如台盼蓝和血细胞计数器，或自动细胞计数器进行细胞计数，同时评估细胞存活率。如果需要，使用流式细胞术检测CD71和GlyA的表达。以200xg离心5-10分钟。吸弃上清液。用Iscove的MDM或StemSpan™培养基（无添加生长因子）清洗一次，以除去残留的红系扩增添加物或其他添加物。细胞产量是可变的，因为它高度依赖于初始CD34⁺细胞样本的质量。在培养两周后，每个初始CD34⁺细胞会至少生成1000个CD71⁺ GlyA⁺细胞的细胞产量，高质量的初始CD34⁺细胞样本有可能获得多达100,000或更多的有核红细胞。如果细胞在扩增培养过程中保持佳状态，存活率应该很高（～90％）。如果细胞生长不理想（每个初始CD34⁺细胞生成<1000个红细胞），或者细胞由于接种密度过高和/或由于不理想的换液及在接种而引起的过度生长，均会导致细胞存活率低于90％。

步骤3. 在成熟条件下进行重新接种

在含有3%正常人AB血清和重组人EPO（浓度为1～3U / mL）的新鲜SFEM II培养基中，以每毫升5-10×10⁵个细胞的浓度重悬细胞。培养基中必需含有人血清，这对于维持细胞存活率是非常重要的。

步骤4. 分析细胞

培养4 - 7天后，通过流式细胞术分析细胞CD71和GlyA的表达。为了测量血红蛋白，可以使用细胞离心机将细胞制备在玻片上并用联苯胺或类似试剂染色。在细胞成熟过程中，细胞数量并不显着增加，细胞存活率不定，通常低于成熟前的数量。此外，细胞变小，CD71表达降低，但在大多数细胞表面仍然可检测到。相反，GlyA维持高表达或进而增加，由于Hb积累，细胞团为明显可见的红色。在显微镜下观察培养物时可以观察到去核细胞，图中标示出网织红细胞和pyrenocyte（挤出的细胞核被包裹在一层薄细胞质层中）（图1）。

图1. 在SFEM II中培养的红系祖细胞在成熟过程中所形成的成核细胞、网织红细胞和pyrenocyte的形态。使用SFEM II 和上述的培养步骤，首先在扩增条件下培养14天，接着在成熟条件下培养7天后，在显微镜下以40倍放大倍率观察红系细胞，包括正常成核细胞（金色箭头），网织红细胞（深灰色箭头）和pyrenocyte（棕色箭头）。

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